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葉綠素含量的測定

一、前言

葉綠素廣泛存在國術(shù)等綠色植物組織中，并在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對光、熱比較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀釋堿液中可水解成鮮綠色的葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種；葉綠素a和b，兩者均易溶于乙醇、yimi、丙酮和lvfang。

葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：

1. 原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進(jìn)而間接計算葉綠素的含量。
2. 分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯比爾定律計算出提取液中各色素的含量。
3. 葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm波長下的吸光值，并根據(jù)經(jīng)驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。

葉綠素與其他顯色物質(zhì)一樣，在溶液中如液層厚度不變則其吸光度與它的濃度成一定的比例關(guān)系。已知葉綠素a、b在652nm波長處有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5）。因此，在此波長下測定葉綠素溶液的吸光度，即可計算出葉綠素a、b的總量。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

1. 材料：水樣或植物中提取的葉綠素溶液
2. 儀器設(shè)備：電子分析天平；UV1800PC紫外可見分光光度計；漏斗：25ml容量瓶；剪刀；濾紙；玻棒等。
3. 試劑：95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉。

四、實驗步驟

1. 樣品的準(zhǔn)備

2.測定

取1CM的比色皿，倒入樣品，以95%乙醇為空白對照，在UV1800PC紫外可見分光光度計625nm波長下讀取吸光度（A）值。

五．計算

將測得的吸光度652nm波長處的吸光度值輸入儀器公式，即可求得樣品中葉綠素濃度。所得結(jié)果再代入公式，即可得出樣品葉綠素的含量。

                A652

C（mg.ml-1)=    34.5

式中：C=葉綠素（a和b）的總濃度（mg.ml-1)

A652------  表示在652nm波長下測得樣品中葉綠素的吸光度

34.5為葉綠素a和b混合溶液在652nm波長的比吸收系數(shù)（比色皿光徑為1CM,樣品濃度為1g.L-1時的吸光度）。

葉綠素含量（mg.g-1Fw）=C（mg.ml-1)×提取液總量（mL）

                               樣品鮮重（g)

方法II

1. 目的

掌握葉綠素a、b含量測定的基本原理和方法。

2.原理

葉綠素a、b分別在663nm和645nm波長處有大的吸收峰，同時在該波長處葉綠素a、b的比吸收吸收K為已知，我們即可以根據(jù)朗博比爾定律，列出濃度C與吸光度A之間的關(guān)系式：

A663=82.04Ca+9.27Cb

A645=16.75Ca+45.6Cb

(1)、（2）式中的A663.A645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時測得的吸光度。

Ca、Cb為葉綠素a、b的濃度，單位為mg,L-1.

82.04、9,27為葉綠素a、b在波長663nm下的比吸收系數(shù)。

16.75、45.6為葉綠素a、b在波長645nm下的比吸收系數(shù)。

解（1）、（2）式聯(lián)立方程，得：

Ca=12.70   A663-2.69 A645

Cb=22.9 A645-4.68A663

CT-Ca+Cb=20.21A645+8.02A663

Ca、Cb為葉綠素a、b的濃度，CT為總?cè)~綠素濃度，單位：（mg,L-1),利用上面（3,4,5）式可以分別計算出葉綠素a、b及總?cè)~綠素濃度。

三、材料、儀器設(shè)備及試劑

1. 材料：菠菜葉、薺菜葉或其他植物葉片
2. 儀器設(shè)備：電子分析天平：分光光度計：恒溫水浴鍋：25ml刻度試管；剪刀；試管；試管架；玻棒等。
3. 試劑：80%乙醇

四實驗步驟

1. 葉綠素的提取
2. 從植株上選取有代表性的葉片數(shù)張（除去粗大葉脈）剪碎后混勻，快速稱取0.2g（可視樣品葉綠素含量高低而增減用量），置于25mL刻度試管中，加80%乙醇10ml左右，加塞放入60-80℃水浴中保溫提取葉綠素（或常溫下放在暗處浸提12~24h），至葉片全部褪綠為止，冷卻后，用80%乙醇定容至刻度，此液即為葉綠素提取液。
3. 測定
4. 取光徑為1CM的比色杯，加入葉綠素提取液距比色皿口1CM處，以80%乙醇作為對照，調(diào)到UV1800PC紫外可見分光光度計的多波長測量狀態(tài)，得出663nm及645nm波長下的吸光度值。

結(jié)果計算

將測定得到的吸光度A663、A645值分別代入式中計算出Ca、Cb及CT（即葉綠素a、b及葉綠素總量濃度）。再按下式計算出葉綠素a、b及葉綠素總含量。

葉綠素a含量（mg.g-1Fw)=      Ca×提取液總量（ml)  

                             樣品鮮重（g）×1000 

葉綠素b含量（mg,g-1 Fw)=     Cb×提取液總量（ml) 

                                樣品鮮重（g)×1000

葉綠素總含量（mg.g-1Fw)=     CT×提取液總量（ml) 

                                樣品鮮重（g)×1000

后計算出葉綠素a/葉綠素b的比值，并加以分析。

原理

根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公司計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A=acl   式中a比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1CM時，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在響應(yīng)波長下吸光度的綜合。這就是吸光度的加和性。此次試驗測定葉綠素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b 時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的大吸收峰。

二．材料、儀器設(shè)備及試劑

• 材料：新鮮（或烘干）的植物葉片。
• 儀器設(shè)備：1.UV1800PC紫外可見分光光度計；2。電子頂載天平（感量0.01g);3.研缽；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量濾紙；7.吸水紙；擦境紙；9滴管。
• 試劑：96%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉。

三．實驗步驟

1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈）混勻。2.稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2~3mL 95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3`5min.3.取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，后連同殘渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。后用乙醇定容至25mL，搖勻。5.把葉綠體色素提取液倒入光徑1CM的比色皿內(nèi)，以95%乙醇為空白，在UV1800PC紫外可見分光光度計單機(jī)模式，多波長測量中得出 波長665nm、649nm下的吸光度值。

實驗結(jié)果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式中：

Ca=13.9665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665.據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb;mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量；

葉綠素的含量（mg/g)=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)】/樣品鮮重（或干重）。